Unterschied zwischen PCR und QPCR - Unterschied Zwischen

Unterschied zwischen PCR und QPCR

Hauptunterschied - PCR vs. QPCR

PCR (Polymerasekettenreaktion) und qPCR (quantitative PCR) sind zwei Techniken, die in der Biotechnologie zum Amplifizieren von DNA für verschiedene Zwecke verwendet werden. PCR ist eine relativ einfache Technik. qPCR ist auch bekannt als Echtzeit-PCR oder digitale PCR. Das Hauptunterschied zwischen PCR und qPCR ist das PCR ist eine qualitative Technik, während qPCR eine quantitative Technik ist. PCR ermöglicht das Ablesen des Ergebnisses als "An- oder Abwesenheit". In qPCR wird jedoch die Menge der in jedem Zyklus amplifizierten DNA quantifiziert. Wenn RNA in der PCR verwendet wird, ist die Technik als RT-PCR (Reverse Transcription PCR) bekannt, und wenn RNA in qPCR verwendet wird, ist die Technik als qRT-PC bekannt.

Wichtige Bereiche

1. Was ist PCR?
- Definition, Prozesse, Verwendungen
2. Was ist QPCR?
- Definition, Prozesse, Verwendungen
3. Was sind die Ähnlichkeiten zwischen PCR und QPCR?
- Überblick über gemeinsame Funktionen
4. Was ist der Unterschied zwischen PCR und QPCR?
- Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe: Agarosegelelektrophorese, Amplicons, DNA-Polymerase, Fluoreszenzfarbstoff, PCR, Sonden, qPCR, RT-qPCR


Was ist PCR?

PCR bezieht sich auf eine Technik in der Biotechnologie, die die Analyse einer kurzen DNA-Sequenz durch Amplifikation eines ausgewählten DNA-Segments ermöglicht. Es ist eine vergleichsweise empfindliche Methode, da bei einer einzigen Reaktion sehr kleine Volumina erforderlich sind. Die Technik basiert auf der Fähigkeit der DNA-Polymerase, neue DNA-Stränge komplementär zum angebotenen Template-Strang zu synthetisieren. Das Reaktionsgemisch der PCR besteht aus DNA-Polymerase, DNA-Nukleotiden, Primern, der zu amplifizierenden DNA-Matrize und Magnesium. Die Amplifikation wird in einem Thermocycler durchgeführt. DNA-Polymerase sollte hitzebeständig sein, da bei dieser Reaktion hohe Temperaturen verwendet werden. Die zwei Arten von DNA-Polymerasen, die bei der PCR verwendet werden, sind Taq DNA-Polymerase und Pfu DNA-Polymerase. Taq DNA-Polymerase wird in der PCR häufig verwendet.

DNA-Polymerase erfordert einen bereits vorhandenen DNA-Strang am 3'-Ende, um einen neuen Strang zu synthetisieren. Daher wird dem Reaktionsgemisch ein Oligonukleotid-Primer zur Initiierung der DNA-Synthese zugesetzt. Das Erfordernis eines Primers in der PCR ermöglicht die Amplifikation nur einer bestimmten Region in der Matrize. Die Zielsequenz wird von Vorwärts- und Rückwärtsprimern flankiert. Am Ende einer PCR werden neue Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz aufgerufen, die aufgerufen werden Ampliconswerden in Milliarden angesammelt. Die Komponenten der PCR sollten so optimiert werden, dass die PCR-Leistung verbessert und gleichzeitig der Ausfall minimiert wird. Die Standard-PCR-Reaktion ist in gezeigt Abbildung 1.


Abbildung 1: PCR

Schritte der PCR

Die drei Schritte einer PCR werden unten beschrieben.

  1. Denaturierung - Die doppelsträngige DNA-Matrize wird durch Erwärmen auf 94-95 ° C in zwei Einzelstränge getrennt.
  2. Glühen - Forward- und Reverse-Primer binden an die komplementären Sequenzen im Template. Die Temperatur hängt von der Schmelztemperatur der Primerkombination ab.
  3. Primer Erweiterung - Das DNA-Polymerase-Enzym verlängert jeden Primer am 3'-Ende, indem es dem wachsenden Strang komplementäre Basen hinzufügt. Die optimale Temperatur von Taq d. h. 72 ° C wird als Temperatur im Verlängerungsschritt verwendet. Der Zeitpunkt der Verlängerung hängt von der Anzahl der Basenpaare im Schablonenstrang ab.

Die drei Schritte werden 28-35 Mal wiederholt. Agarosegelelektrophorese wird bei der Größenfraktionierung von PCR-Produkten verwendet. Das Produkt wird mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht beobachtet. Das PCR-Produkt oder die amplifizierte DNA kann bei der Klonierung, Sequenzierung oder Genotypisierung verwendet werden.

Was ist QPCR?

QPCR bezieht sich auf eine Technik in der Biotechnologie, die den Nachweis, die Charakterisierung und die Quantifizierung von Nukleinsäuren für verschiedene Anwendungen ermöglicht. Daher handelt es sich um eine Art quantitativer PCR. Sowohl DNA als auch RNA können als qPCR verwendet werden. Wenn RNA als Template verwendet wird, sollte diese zunächst in cDNA revers transkribiert werden. Daher ist diese Art von qPCR als bekannt RT-qPCR. Die herkömmliche PCR wird für cDNA- oder herkömmliche DNA-Proben durchgeführt. In qPCR werden jedoch Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, um das PCR-Produkt in jedem Schritt des PCR-Zyklus zu markieren. Dies ermöglicht das Sammeln von Daten mit fortschreitender PCR, wodurch die Quantifizierung der Amplikons während der exponentiellen Phase der PCR ermöglicht wird. Der in qPCR verwendete Farbstofftyp ist hauptsächlich SYBR Green. Der Farbstoff bindet an die doppelsträngige DNA. Da die Fluoreszenz proportional zur Menge der amplifizierten DNA steigt, kann die Quantifizierung in „Echtzeit“ erfolgen. Der Hauptnachteil der Verwendung des Farbstoffs besteht darin, dass er die Quantifizierung eines bestimmten Produkts in der Probe ermöglicht. Neben Farbstoffen können auch Sonden im Quantifizierungsprozess eingesetzt werden. TaqMan-Sonden sind eine der Hauptarten von Oligonukleotidsonden, die in qPCR verwendet werden. Der Vorgang der Fluoreszenzemission ist in gezeigt Figur 2.


Abbildung 2: TaqMan Probe

Sonden können so konstruiert werden, dass mehrere PCR-Produkte in derselben Probe nachgewiesen werden. Die TaqMan-Sonde ist eine der Hauptarten von Hydrolyse-Sonden; Der Einbau dieser Sonde in das PCR-Produkt legt den Fluorophor frei und emittiert die Fluoreszenz. Fluoreszenzfarbstoffe sind spezifischer für das PCR-Produkt. Daher werden sie in den meisten diagnostischen Tests zum Nachweis des PCR-Produkts verwendet.

Ähnlichkeiten zwischen PCR und QPCR

  • PCR und qPCR sind zwei Arten von Techniken, die in der Biotechnologie verwendet werden, um DNA für verschiedene Zwecke zu amplifizieren.
  • Die traditionelle Polymerase-Kettenreaktion wird sowohl in der PCR als auch in der qPCR als Kerntechnik durchgeführt.
  • RNA kann sowohl in der PCR als auch in der qPCR verwendet werden, indem als erste Reaktion die reverse Transkription verwendet wird.

Unterschied zwischen PCR und QPCR

Definition

PCR: PCR ist eine Technik in der Biotechnologie, die die Analyse einer kurzen DNA-Sequenz durch Amplifikation eines ausgewählten DNA-Segments ermöglicht.

QPCR: QPCR ist eine Technik in der Biotechnologie, mit der Nukleinsäuren für verschiedene Anwendungen nachgewiesen, charakterisiert und quantifiziert werden können.

Quantitativ qualitativ

PCR: PCR ist eine qualitative Technik.

QPCR: QPCR ist eine quantitative Technik.

Erkennung des Produkts

PCR: Das Produkt wird durch Agarosegelelektrophorese in der PCR nachgewiesen.

QPCR: Das Produkt kann in jedem Amplifikationszyklus in qPCR nachgewiesen werden.

Datensammlung

PCR: Die Daten werden am Ende der Reaktion in der PCR gesammelt.

QPCR: Die Daten werden während der exponentiellen Reaktionsphase in qPCR erfasst.

Auflösung

PCR: PCR hat eine sehr schlechte Auflösung.

QPCR: QPCR hat eine sehr hohe Auflösung.

Farbstoffe

PCR: Die PCR verwendet Ethidiumbromid, um das Produkt während der PCR zu färben.

QPCR: QPCR verwendet Fluoreszenzfarbstoffe, um das Produkt zu erkennen.

Zeit

PCR: PCR ist eine zeitaufwendigere Methode.

QPCR: QPCR ist weniger zeitaufwändig.

RNA

PCR: RT-PCR ist die Art von PCR, die RNA als Template verwendet.

QPCR: RT-qPCR ist der Typ von qPCR, der RNA als Template verwendet.

Rolle

PCR: PCR wird zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter genomischer Fragmente verwendet.

QPCR: QPCR wird verwendet, um ein bestimmtes Fragment in einer Probe zu quantifizieren.

Fazit

PCR und qPCR sind zwei Arten von Techniken, die in der Biotechnologie verwendet werden, um DNA für verschiedene Zwecke zu amplifizieren. PCR ist das traditionelle Amplifikationsverfahren, mit dem die Anwesenheit oder Abwesenheit eines DNA-Fragments identifiziert wird. QPCR wird verwendet, um ein bestimmtes Fragment in einer Probe zu quantifizieren. Daher ist PCR eine qualitative Technik, während qPCR eine quantitative Technik ist. Dies ist der Hauptunterschied zwischen PCR und qPCR.

Referenz:

1. "QPCR vs. digitale PCR vs. traditionelle PCR."Thermo Fisher Scientific,